بررسی بیان ژن پروانسولین انسانی منتقل شده به کلروپلاست گیاه توتون در سطوح dna، rna و پروتئین

تولید زیست داروها و پروتئین های نوترکیب با استفاده از گیاهان به عنوان بیوراکتور در حجم انبوه و ارزان تحت عنوان زراعت ملکولی (molecular farming) معرفی می شود. دیابت به عنوان نارسایی سوخت و سازی گروه بندی شده است که در آن بدن از فقدان و یا عدم امکان استفاده از هورمون انسولین رنج می برد. با وجود تولید انسولین در سیستم های باکتریایی و مخمری تحقیقات بیشتر برای سایر روش های تولید پروتئین انسولین شامل بیان در گیاهان متمرکز شده است. گیاه توتون با نام علمی nicotiana متعلق به خانواده solanaceae و گونه tabacumمی باشد که تاکنون بیشترین استفاده را جهت تولید پروتئین های نوترکیب در بین گونه های گیاهی به خود اختصاص داده است. پروتئین های نوترکیب تولیدی در گیاهان می توانند به واحدهای زیرسلولی متفاوت در سلول های گیاهی نظیر سیتوزول، آپوپلاست، شبکه آندوپلاسمی، کلروپلاست و یا واکوئل هدف گیری شوند. انتخاب صحیح واحد زیر سلولی جهت بیان پروتئین نوترکیب، نقش مهمی در سطوح تولید پروتئین های هترولوگ دارد. بیان پروتئین های نوترکیب در کلروپلاست مزایای متعددی نظیر افزایش بیان ژن هدف و محدود نگه داشتن ژن انتقال یافته را به همراه دارد. ژن پروانسولین انسانی به همراه ژن مقاومت به آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین- استرپتومایسین توسط تیم تحقیقاتی دکتر جلالی با استفاده از وکتور pkcz و به روش تفنگ ژنی به کلروپلاست گیاه توتون انتقال یافته است. در قالب این پروژه، مراحل انجام باززایی و انتخاب گیاهان تراریخته بر روی محیط باززایی حاوی آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین به منظور افزایش هموپلاسمی طی حداقل سه نسل انجام شد. بررسی گیاهان ترانسپلاستومیک در سطوح مختلف dna، rna و پروتئین به منظور تایید درج و بیان ژن در کلروپلاست گیاه توتون انجام شد. بررسی این گیاهان در سطح dna با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن پروانسولین، درج این ژن را در ژنوم کلروپلاستی گیاهان تایید کرد، به علاوه با آزمون rt-pcr رونویسی ژن هدف تایید شد. همچنین آزمون های بلات نقطه ای، الیزا و وسترن بلات به منظور اثبات بیان ژن هدف در سطح پروتئین و تعیین میزان پروتئین تولید شده انجام شد. در ادامه این پروژه جوانه زنی بذور نسل t1 روی محیط ms حاوی غلظت های مختلف آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین و استرپتومایسین نیز مورد بررسی قرار گرفت.